Efeito do pré-condicionamento isquêmico remoto em modelo de lesão hepática por isquemia-reperfusão em ratos

A lesão por isquemia-reperfusão (I/R) é o mecanismo fisiopatológico central no desenvolvimento da insuficiência hepática pós-operatória. Diversas estratégias para minimizar suas consequências estão sendo desenvolvidas, mas ainda sem resultados satisfatórios. Recentemente o pré-condicionamento isquêmico remoto (PCIR), método em que ciclos breves de I/R aplicados em um órgão ou membro é capaz de atenuar os resultados da I/R em um órgão distante, vem sendo utilizado, em modelos experimentais, com resultados promissores. No entanto seu mecanismo de ação ainda não foi esclarecido. Um dos mecanismos propostos é a modulação na expressão das citocinas sintetizadas durante a resposta inflamatória que acompanha o processo de I/R. Foram utilizados 36 ratos (Rattus norvegicus), machos, com peso entre 250 e 280 g, divididos em três grupos: Grupo Sham, cirurgia simulada; Grupo IR, isquemia de 70% do fígado por 45 minutos e reperfusão; e Grupo PCIR, pré-condicionamento isquêmico remoto do fígado através de seis ciclos de isquemia-reperfusão da pata do animal, com quatro minutos de isquemia e quatro minutos de reperfusão em cada ciclo, seguido de isquemia hepática semelhante ao do Grupo IR. Terminado os procedimentos cirúrgicos, metade dos animais foi morta decorridos 60 minutos de reperfusão, e a outra metade após 180 minutos. Foi coletado tecido hepático do lobo submetido à isquemia, para estudo histopatológico, utilizando o índice de injúria hepática modificado; e sangue, para dosagem plasmática de TNF-α, IL-6, IL-10 e ALT. A análise histopatológica mostrou que a necrose celular foi significativamente reduzida no Grupo PCIR quando comparado com Grupo IR (p <0,0001). As transaminases mostraram o mesmo padrão com redução significativa dos seus valores no Grupo PCIR quando comparados com o Grupo I-R (p <0,0001). A dosagem das interleucinas mostrou redução significativa na expressão da IL-6 no Grupo PCIR quando comparado com o Grupo IR (p<0,001). Houve aumento da expressão de IL-10 nos grupo PCIR, porém não atingiu significância estatística. Não foi identificada diferença na dosagem de TNF-α nos grupos estudados. O PCI-R foi eficaz na redução na necrose celular resultante da lesão por I-R nos grupos estudados. A redução na síntese de IL-6 segue o padrão observado em outros estudos.

Quantificação das células estreladas ativadas / miofibroblastos e análise da apoptose das células do fígado durante a terapia celular na fibrose hepática em ratos

A fibrose hepática é o resultado de uma resposta cicatrizante frente a repetidas lesões no fígado, e é caracterizada pelo acúmulo excessivo de proteínas da matriz extracelular (MEC) no parênquima hepático, incluindo colágeno, fibronectina, elastina, laminina e proteoglicanos, com a participação de diferentes populações celulares do fígado. As principais células responsáveis pela síntese de proteínas da MEC na fibrose hepática são as células estreladas hepáticas ativadas e os miofibroblastos, que surgem após estímulo inflamatório e são caracterizadas pela expressão de alfa-actina de músculo liso (α-SMA). Sabe-se que durante a progressão da fibrose hepática, ocorre a morte de hepatócitos e sua substituição por células fibrogênicas α-SMA+. A apoptose dessas células fibrogênicas é de grande relevância para a regressão da fibrose e regeneração hepática. Nos últimos anos, a terapia com células tronco de medula óssea tem sido utilizada para estimular a regeneração hepática em diferentes modelos experimentais e protocolos clínicos. A fração mononuclear da medula óssea adulta possui duas populações de células-tronco importantes no tratamento de diversas doenças hepáticas: células-tronco hematopoiéticas e células-tronco mesenquimais. O objetivo deste estudo foi analisar a expressão de α-SMA e o processo de apoptose de células hepáticas durante a fibrose hepática induzida por ligadura do ducto biliar (LDB) e após o transplante de células mononucleares de medula óssea (CMMO). Os fígados foram coletados de ratos dos seguintes grupos: normal, 14 dias de LDB, 21 dias de LDB e animais que receberam CMMO após 14 dias de LDB, e foram analisados após 7 dias (totalizando 21 dias de LDB). Para quantificar a expressão de α-SMA por células fibrogênicas nos grupos experimentais, foi realizada imunoperoxidase para α-SMA, seguida de morfometria no programa Image Pro Plus. Para analisar a apoptose nas células hepáticas, foi realizada imunoperoxidase e Western Blotting (WB) para caspase-3 (proteína apoptótica) e imunofluorescência com dupla-marcação para caspase-3 e α-SMA, seguida de observação em microscópio confocal. Os resultados da quantificação de α-SMA por morfometria mostraram que a expressão de α-SMA aumentou significativamente 14 e 21 dias após a LDB. Entretanto, essa expressão diminuiu significativamente no grupo tratado com CMMO, que apresentou parênquima hepático mais preservado em relação ao grupo com 21 dias de LDB. Os resultados de imunoperoxidase, WB e microscopia confocal para expressão de caspase-3 demonstraram que essa proteína diminuiu nos animais fibróticos com 14 e 21 dias de LDB com relação ao grupo normal, e estava significativamente elevada no grupo tratado com CMMO. A análise por microscopia confocal demonstrou que algumas células coexpressaram α-SMA e caspase-3 nos animais tratados com CMMO, sugerindo a morte de células fibrogênicas e remodelamento do parênquima hepático.

O transplante de células mononucleares de medula óssea contribui para o remodelamento da matriz extracelular durante a regeneração do fígado em ratos com fibrose hepática induzida por ligadura do ducto biliar

A fibrose hepática é o resultado de uma lesão crônica, com a ativação de células inflamatórias e fibrogênicas no fígado, as quais levam a um acúmulo excessivo de proteínas de matriz extracelular (MEC). Essas alterações resultam na morte de células do fígado, com desorganização e perda da função do parênquima hepático. A cirrose é o estágio avançado da fibrose, e culmina na falência hepática, uma condição potencialmente fatal cujo único tratamento efetivo é o transplante de fígado, o qual é limitado pela disponibilidade de órgãos. Na busca por terapias alternativas visando a regeneração hepática, o transplante de células mononucleares de medula óssea (CMMO) mostrou resultados benéficos e promissores em modelos animais e alguns protocolos clínicos. Entre essas células, estão as células-tronco hematopoiéticas e mesenquimais, que apresentam potencial regenerativo e modulador da resposta inflamatória. Este estudo pretendeu avançar na compreensão dos mecanismos pelos quais as CMMO podem ajudar na regeneração hepática. Ratos com fibrose hepática induzida por ligadura do ducto biliar (LDB) foram transplantados com CMMO e comparados com ratos com fibrose sem transplante e ratos normais. Parâmetros hepáticos como componentes da MEC (colágeno total, colágenos tipos I e IV, laminina, metaloproteinases de matriz MMPs), componentes celulares (células fibrogênicas, células de Kupffer e colangiócitos) e enzimas hepáticas foram analisados por microscopia de luz, microscopia confocal, western blotting e espectrofotometria. Os resultados mostraram que o transplante de CMMO contribui para a regeneração hepática de maneira global, (a) diminuindo o acúmulo de colágeno e laminina; (b) aumentando a produção de MMPs que favorecem o remodelamento da MEC, principalmente por células de Kupffer; (c) normalizando a quantidade de colangiócitos e diminuindo a quantidade de células fibrogênicas; e (d) normalizando os níveis sanguíneos das enzimas hepáticas. Portanto, nós sugerimos que as CMMO podem ajudar na regeneração hepática através de mecanismos parácrinos e se diferenciando em células de Kupffer, contribuindo para a secreção de fatores antiinflamatórios e anti-fibrogênicos no fígado com fibrose.

ELF (Enhanced Liver Fibrosis) como marcador não invasivo de fibrose hepáticana hepatite C crônica

A fibrose hepática é o aspecto mais relevante e o mais importante determinante de morbimortalidade na hepatite C crônica (HCC). Historicamente, a biópsia hepática é o método de referência para avaliação da fibrose causada pela HCC, apesar de apresentar limitações. O estudo de marcadores não invasivos, que possam obviar a necessidade da biópsia, é uma área de constante interesse na hepatologia. Idealmente, a avaliação da fibrose hepática deveria ser acurada, simples, prontamente disponível, de baixo custo e informar sobre o prognóstico da patologia. Os marcadores não invasivos mais estudados são a elastografia hepática transitória (EHT) e os laboratoriais. A EHT já foi extensamente validada na HCC e está inserida na rotina de avaliação destes pacientes. Dentre os laboratoriais, existem diversos testes em continua experimentação e, até o momento, nenhum foi integrado à prática clínica no Brasil, embora já aplicados rotineiramente em outros países. O Enhanced Liver Fibrosis (ELF), um teste que dosa no soro ácido hialurônico, pró-peptídeo amino-terminal do colágeno tipo III e inibidor tissular da metaloproteinase 1, tem se mostrado bastante eficaz na detecção de fibrose hepática significativa e de cirrose na HCC. Neste estudo o ELF teve o seu desempenho avaliado em relação a biópsia hepática e demonstrou apresentar boa acurácia na detecção tanto de fibrose significativa quanto de cirrose. Na comparação com a EHT apresentou acurácia semelhante para estes mesmos desfechos, com significância estatística. No entanto, foi observada uma superestimação da fibrose com a utilização dos pontos de corte propostos pelo fabricante. Este achado está em acordo com a literatura, onde não há consenso sobre o melhor ponto de corte a ser empregado na prática clínica. Com a ampliação da casuística foi possível propor novos pontos de corte, através da análise clássica, com a biópsia hepática como padrão ouro. O resultado obtido vai ao encontro do observado por outros autores. Em seguida, os novos pontos de corte do ELF foram reavaliados sem que a biópsia hepática fosse a referência, através da análise de classes latentes. Mais uma vez o ELF apresentou bom desempenho, inclusive com melhora de suas sensibilidade e especificidade em comparação com a análise clássica, onde a biópsia hepática é a referência. Assim sendo, é possível concluir que o ELF é um bom marcador não invasivo de fibrose hepática. No entanto, para detecção de fibrose significativa e cirrose, deve ser considerada a aplicação na prática clínica dos novos pontos de corte aqui propostos.

Estudo do efeito do transplante de células mononucleares de medula óssea na bioenergética mitocondrial de ratos com fibrose hepática

A disfunção mitocondrial tem sido associada a várias doenças, incluindo a colestase hepática, caracterizada pela ativação de células de Kupffer e células fibrogênicas, as quais produzem matriz extracelular excessiva. O acúmulo de sais biliares tóxicos no parênquima hepático leva à lesão crônica com dano mitocondrial, redução da síntese de ATP, aumento de espécies reativas de oxigênio (ROS) e apoptose, resultando em comprometimento da função hepática. Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram o efeito positivo do transplante de células mononucleares da medula óssea (CMMO) na resolução da fibrose hepática e recuperação da função hepática em ratos com colestase, induzida pela ligadura de ducto biliar (LDB). Assim, o presente estudo teve como objetivo analisar a bioenergética mitocondrial após o transplante de CMMO no fígado de ratos com fibrose induzida por ligadura de ducto bilar (LDB). Ratos Wistar machos foram divididos em quatro grupos: animais normais, animais com fibrose hepática após 14 e 21 dias de LDB (F14d e F21d, respectivamente), e animais que após 14 dias de LDB receberam 1x107 CMMO, e foram eutanasiados sete dias após. Nossos dados demonstraram aumento do conteúdo de colágeno tipo I no grupo F21d em relação ao grupo normal, indicativo de fibrose, e sua diminuição após o transplante de CMMO. A análise da fisiologia mitocondrial do fígado mostrou diminuição significativa da taxa respiratória máxima estimulada por ADP (estado 3) nos grupos F14d e F21d, indicando redução da capacidade de oxidação de carboidratos e ácidos graxos. Além disso, a razão do controle respiratório (RCR), indicativa de acoplamento da fosforilação oxidativa com a produção de ATP, apresentou-se significativamente diminuída nos grupos F14d e F21d, sugerindo desacoplamento mitocondrial. No entanto, o transplante de CMMO aumentou significativamente nestes grupos tanto a capacidade oxidativa quanto o acoplamento mitocondrial a níveis semelhantes aos do grupo normal. Estes resultados foram confirmados por análise de western blotting, que mostrou aumento significativo no conteúdo de UCP2 e diminuição do conteúdo de PGC-1α no grupo F21d, com consequente restauração após o transplante de CMMO. Além disso, os resultados mostraram um aumento significativo do conteúdo de 4-HNE no grupo F14d com redução após o transplante CMMO. Assim, podemos concluir que o transplante de CMMO tem um efeito positivo sobre a bioenergética mitocondrial de fígados de ratos com colestase, com aumento da capacidade oxidativa e redução do estresse oxidativo, o que, por sua vez, contribui para a recuperação da função hepática.